外泌体提取纯化试剂盒-柱法（细胞上清）

产品简介：

外泌体是由细胞分泌的包含 RNA和蛋白质的小囊泡（30-150 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等体液中大量存在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能，在特定细胞之间传递它们的效应物或信号分子；然而其构造、效应物组成以及所参与的生物学通路目前尚不明晰。

外泌体的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒，而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。由本公司自主开发的外泌体提取纯化试剂盒，适用于细胞培养上清液（也可用于尿液）中的外泌体提取纯化，5T可以提取100ml细胞上清液。试剂盒采用阴离子交换色谱法原理，与被分离样品中带负电荷的外泌体相结合，从而实现外泌体的分离。该试剂盒具有快速、高效、获得的外泌体纯度高等特点，可用于电镜分析、NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。

保存条件: 

室温保存，2年有效。

产品组成：

* Nuclease-free, Sterile

自备材料：

高速离心机，0.45 μm或0.22 μm过滤器， 100 KD 超滤柱、铁架台。

产品使用：

一、 样品预处理

1.      取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后置于4℃解冻，融化后置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后直接置于冰上；

2.      样品处理量（单个柱子处理量）：

注：每个“Exosome Extraction Column”处理量 10~20 mL（未经浓缩的原始上清），样品过少可能导致获得的外泌体浓度低，样品过多可能导致堵柱。

3.      离心去细胞：样品于4℃以300 ×g（~1,640 rpm**） 离心5 min，去除样品中的细胞； **为约10 cm有效离心半径的大离心机换算（≥15 mL离心管），下同。

4.      离心去细胞碎片：将去除细胞后的样品于4℃以3,000 ×g（~5,200 rpm**）离心10 min，去除样品中的细胞碎片（注：若沉淀较多，可3,000 ×g，10 min离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）；

5.      上清液过滤：去除细胞碎片的离心上清液用 0.45 μm 或0.22 μm过滤器过滤至新的容器中。

二、 提取前准备

1.      固定外泌体提取柱（Exosome Extraction Column）：取出提取柱，将提取柱上下筛板取下后垂直固定于试管架或铁架台上，待填料保存液自然流尽；

2.      加入Solution A溶液：填料保存液流尽后沿柱子内壁缓慢加入5 mL Solution A溶液，待Solution A溶液自然流尽；

3.      加入Solution B溶液：Solution A流尽后沿柱子内壁缓慢加入5 mL Solution B溶液，待 Solution B溶液 自然流尽，等待上样。

三、 提取外泌体

1.      过柱：将经0.45 μm或0.22 μm过滤器过滤后的细胞上清液沿柱子内壁缓慢多次加入提取柱中，待细胞上清液自然流尽（注：每个“Exosome Extraction Column”上样量10~20 mL（未经浓缩的原始上清），样品过少可能导致获得的外泌体浓度低，样品过多可能导致堵 柱）；

2.      平衡：细胞上清液流尽后沿柱子内壁缓慢多次加入 15 mL Solution B 溶液，待Solution B溶液自然流尽；

3.      洗杂：Solution B溶液流尽后沿柱子内壁缓慢加入 0.8 mL Solution C 溶液，待Solution C溶液自然流尽；

4.      洗脱：待上步骤中Solution C溶液流尽后沿柱子内壁再次缓慢加入1 mL Solution C溶液，收集该流穿液（该流穿液中富含外泌体颗粒）；

5.      浓缩（选做）：若外泌体浓度过低，可用100 KD超滤柱将流穿液适当浓缩；

6.      纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃以 3,000 ×g（~6,200 rpm*）离心10 min，离心后收集EPF 柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体（注：EPF 柱不可重复使用）；

*为约7 cm有效离心半径的小离心机换算（≤2 mL离心管）。

7.      外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。

注意事项：

1.      新的Exosome Extraction Column柱子的上筛板和填料表面之间可能存在一定的空隙，该现象是运输过程中晃荡造成的，并不影响其性能，实验前将筛板向下推动至填料表面即可；

2.      Exosome Extraction Column 和 Exosome Purification Filter 均为一次性耗材，请勿重复利用，否则可能会造成堵柱而损失样品；

3.      Solution C 为 Tris 缓冲盐溶液；

4.      流穿液呈红色，是由于培养基中色素和外泌体同时被洗脱所致，不影响后续实验。若需去除色素，可使用100 KD超滤柱置换缓冲液；

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！

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