水溶性外泌体荧光标记染料（Aco-490，青色）

Water-soluble Fluorescent Dye (Aco-490, cyan)

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产品简介：

Acoerela 的 Aco-490 属于水溶性、跨膜的共轭寡电解质（COEs）。这类亲脂性染料具备独特性能，能够完全嵌入目标膜的脂质双层，从根源上最大程度减少染料从目标中“泄漏”的情况发生。

在荧光特性方面，Aco-490 只有在与目标膜结合时，才会呈现出显著的荧光增强效果。同时，Aco-490 具有极高的水溶性，溶解在水性缓冲液时，既不会形成胶束，也不会产生纳米颗粒。这一特性使其在纳米流式分析以及细胞摄取实验中，能够有效规避假阳性结果的出现，确保实验数据的准确性与可靠性。

产品参数：

溶剂：水性缓冲液（PBS 或 Opti-MEM）

推荐激光器：405 nm（紫光）

发射峰范围：458–508 nm

常用检测通道：BV421/DAPI/Pacific Blue

保存条件: 

2-8℃避光保存，2年有效。

产品组成：

产品使用：

一、染料工作液制备

1.      取染料管，加入25μL水性缓冲液（推荐使用PBS或Opti-MEM溶解），配置成浓度为 25μM的储存液；

2.      使用涡旋振荡器充分振荡1min 至染料完全溶解；

3.      40°C水浴15min（如有超声设备，可同步开启超声辅助溶解）；

4.      取洁净EP管，对储存液进行分装；

5.      取适量储存液，用缓冲液稀释至10μM的工作浓度。

二、外泌体染色

1.      将纯化的细胞外囊泡(EVs)浓度调整至10¹¹ Particles/mL；

2.      按表1构建染色孵育体系：

表1. Aco-490标记外泌体（EV）的样本制备50μL体系

3.      加入染料工作液后，盖紧离心管盖，用枪头轻柔吹吸混匀，放置于37℃环境，避光孵育2小时。

三、去除游离染料

1.      染色完成后，在样品中加入2倍体积的PBS，使用100 KDa超滤管*，以3000 ×g的离心力离心 5~10min，进行超滤置换，去除溶液中游离的染料，将上室样品浓缩至原体积；

2.      重复上述超滤置换步骤 2 次；

*注：完成本次实验后，请丢弃超滤管，切勿留作下次实验重复使用。

3.      收集超滤管上室的样本，即为染色后的外泌体；

4.      染色后的外泌体建议尽快使用，若在2周内使用，可置于 4℃ 环境中避光保存；如需长期保存，可置于-80℃冷冻保存，保存时间过长可能影响下游实验效果。

四、细胞摄取

1.      提前24小时铺种目标细胞；

2.      用不含外泌体的细胞培养基将染色样本稀释5~10 倍，使染色EV浓度调整为约 5E+09Particles/mL（超滤后外泌体得率约为20%）；

3.      吸除待处理细胞原有的培养基；

4.      加入含染色EV的新鲜培养基，在细胞培养箱避光孵育24 小时；

5.      孵育24小时后，弃去含有染料的孵育液，用PBS 清洗细胞3次；

6.      根据实验需求选择成像观察方式，可直接进行活体成像， 也可固定细胞后成像观察；

7.      若选择固定细胞后成像，使用细胞固定剂在室温下固定15 min（固定后观察细胞形态是否发生变化，部分固定液渗透压不稳定，可能导致细胞变形）；

8.      弃去固定剂，用PBS清洗细胞3次，每次5min；

9.      使用含DAPI的封片剂进行封片（或先用DAPI进行核染10 min，PBS清洗3次，每次5min，之后进行封片）；

10.  共聚焦成像： Aco-490的荧光信号可使用405 nm激光器激发，发射波长从458–508nm收集，常用通道为 DAPI / BV421。

11.  由于 Aco-490与 DAPI激发光相同且发射光谱部分重叠，建议采用顺序扫描：先收集Aco-490信号，再收集其他通道信号（如 FITC/PE），避免光谱串扰。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请注意全程避光，以减缓荧光淬灭。

2.      染料工作液应现配现用，不能提前配制，否则将影响染色效果。

3.      Aco-490染色固定细胞时，样品宜使用4%多聚甲醛进行固定，使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。

4.      关于外泌体染色后去除游离染料：外泌体染色步骤中去除游离染料的步骤必不可少，以避免游离染料对后期实验的干扰。为保证超滤后有足够的外泌体回收量，建议用于染料标记的外泌体原始浓度达到 10¹¹ Particles/mL。

5.      染料标记外泌体与细胞共孵育条件：染料标记外泌体与细胞共孵育的培养条件尽可能使用无血清培养基，以提高细胞对染料标记外泌体的摄取效率，共孵育参考时长为 24 小时。

6.      Aco-490能否与抗体共染？ 可以。推荐顺序：先加 Aco-490 37°C染色 1 小时， 再加抗体室温孵育 1 小时。

7.      Aco-490 能否与 DAPI 共染？ 可以。Aco-490 的发射范围（458–508 nm）与 DAPI 的发射范围（~460 nm）有部分重叠，共聚焦成像时建议顺序扫描，纳米流式检测时设置合适补偿。

8.      Aco-490 在 CytoFLEX nano上为什么用B531 通道更好？ 由于 CytoFLEX nano 的共线激光设计，Aco-490 信号会出现在B531通道（蓝光通道）而非预期的V447通道。在 CytoFLEX LX/S 等空间分离激光的仪器上，则会正常出现在紫光通道。

9.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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