快速支原体检测试剂盒

产品简介：

快速支原体检测试剂盒主要用于检测细胞培养上清或别的液体样品（如血清）中是否含有支原体污染，该试剂盒仅用于基础科研。

本试剂盒可以检测：（1）M.Hyorhinis、（2）M.Fermentans、（3） M.Arginini、（4） M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）AcholeplasmaLaidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis等几乎所有常见的污染细胞的支原体（注：M.为Mycoplasma的缩写）。

以上13种支原体约占细胞支原体污染的99%以上，本试剂盒产品全部可以检测。绝大多数支原体污染集中于前8种。注意：本试剂盒无法检测UreaplasmaUrealy-ticum支原体！该支原体在支原体污染种极其罕见。

保存条件: 

-20℃保存，1年有效。

产品组成：

与PCR法检测支原体比较，本试剂盒产品优势显著：

产品使用：

一、 待测样品的准备

为了准确判断细胞是否有支原体的污染，待测的细胞培养液样品最好来源于至少培养三天且汇合度在 70%~90% 左右的细胞培养上清（贴壁细胞），无需离心。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后，至少让细胞生长3天再取培养液进行检测，也无需离心。哺乳动物细胞的存在不会影响检测结果。

注：收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月，在-80℃可以长期保存。此外，为了节约检测成本，可以将不同时间收集的样品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起检测。

二、 反应体系的配制

表1 恒温反应体系的配制

1.      溶液Ⅰ、溶液Ⅲ从-20℃冰箱中取出，待其融化后（可在37℃水浴内放置5~10 min以帮助融化），从-20℃冰箱中取出溶液Ⅱ置于冰上。吹吸均匀后，按表1比例，混合溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ。如有多个样品，为了防止移液误差，建议溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ用量乘以系数1.06，保证每个反应管中的反应液足量。从配液开始的所有步骤，均在冰上操作。

举例：如果待测样品为3个（加上1个阴性和1个阳性对照），则样品总数为5个。溶液Ⅰ的总体积为 21.5×5×1.06=113.95 μL，溶 液 Ⅱ 的总体积为1×5×1.06=5.3 μL，溶液Ⅲ的总体积为0.5×5×1.06= 2.65 μL，将溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ混合均匀。

注：溶液Ⅱ必须一直在-20℃冰箱中保存并在操作时置于冰上。溶液Ⅱ即使在-20℃条件下仍为液态，不需置于室温。

2.      将上述配制好的反应体系吹打均匀后按每管 23 μL 分装到0.2 mL的PCR管中。尽量保证每管的反应液体积一样。PCR管应该使用透明度良好的薄壁PCR管。

3.      往测试管（Test）中加入2 μL待测细胞培养液；往阳性对照管（Positive）中加入2 μL 阳性支原体DNA； 往阴性对照管（Negative）中加入2 μL灭菌水；反应总体积为25 μL。 注1：装有阳性支原体DNA的螺口管开盖之前，需要短暂离心。

注2：进行反应体系配制的房间，与进行样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间最好分开。

三、 反应

PCR仪设置程序：61℃，60 min；10℃, forever；热盖温度，100℃。

注：若实验室反应场所没有PCR仪，可用水浴锅代替，水浴锅显示温度与实际温度的温差不超过0.5℃，另须往每个反应管内加入25 μL矿物油，以防止水份挥发，然后盖上盖子，将反应管插入带孔的漂板内，放入已经升温到61℃ 的水浴内，准确反应60 min。

四、 结果判断

61℃反应60 min后，立刻取出反应管，放于室温。以一张白纸或白色泡沫盒为背景，通过反应管溶液颜色的变化， 即可判断检测结果。如果溶液为蓝绿色，则说明有支原体污染；如果为紫红色，则说明没有支原体污染。

注：在 61℃反应的时间必须准确计时，最多不得超过5 min，以免出现假阳性。必须在反应后2 h内进行结果判断，避免室温下扩增反应进行，影响结果判别。

Negative reaction                      Positive reaction

注意事项：

1.      必须确保使用的移液枪本身没有残留的支原体，尽量用新购移液器、新开封的枪头操作；整个操作过程，佩戴口罩，不要开口说话。由于本试剂盒非常灵敏，移液枪如吸附有，或者人为带入支原体均有可能造成假阳性。

2.      最好使用带滤芯的吸头吸取溶液和阳性支原体等。如果没有带滤芯的吸头，至少应该使用新开封的吸头。

3.      检测过程中，用过的各类吸头、离心管务必小心处理，应装入含有半瓶水的带盖的、可密封的垃圾瓶内。反应后的PCR管，不要开盖，用过后将其用自封袋密闭，扔到远离细胞房的独立垃圾桶内。

4.      如果细胞被支原体污染，可以选购支原体去除试剂（货号：NW3207）尽早去除。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！