Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒

产品简介：

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细 胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V 进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚 期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可 以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不以应低1×10⁵，不推荐用于检测组织样本。

保存条件: 

4℃避光保存，1年有效。

产品组成：

产品使用：

1、悬浮细胞离心（2000rpm离心5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注： 胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；

2、用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集1~5×10⁵细胞；

3、加入500uL的Binding Buffer悬浮细胞；

4、加入5uL Annexin V-FITC混匀后，加入5uL Propidium Iodide，混匀；

5、室温、避光、反应5～15min；

6、请在1h内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。

A．荧光显微镜观察

1) 滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞；

2) 对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；

1、将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；

2、用PBS洗涤细胞两次；

3、在500uL的Binding Buffer中加入5uL Annexin V-FITC，5uL Propidium Iodide，混匀；

4、将上述溶液滴加于盖玻片表面，使盖玻片表面均匀覆盖；

5、避光、室温反应5min。

6、将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下、双色滤光片（FITC和罗丹明）观察。Annexin  V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

B. 流式细胞仪分析

1) 用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm；发射波长Em=530nm。

2) Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光（流式Ex=488nm,Em≥630nm）通过FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。  

3) 荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重 叠和设定十字门的位置。 

结果示例：

注意事项：

1.      微量试剂需离心数秒，将试剂收集至管底后再开盖取用。

2.      Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

3.      推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮刀会造成细胞粘连成团，而影响检测。可将胰酶消化后的细胞保存在含2% BSA的PBS中，防止进一步的损伤。

4.      细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

5.      因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

6.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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