pH荧光探针（红600-PEG12 马来酰亚胺）

产品简介：

pH Red 600-PEG12马来酰亚胺是一种硫醇反应性pH敏感荧光染料，专为开发活细胞检测用荧光pH探针而设计，可应用于抗体内化、内吞作用及吞噬作用等研究过程。该染料通过引入聚乙二醇（PEG12）间隔臂结构，显著提升了水溶性，在保持生物活性的同时有效降低了生物偶联物的聚集倾向。

该染料具有反常规的pH依赖性荧光特性与多数荧光染料在碱性条件下增强的特性相反，其在中性至酸性环境转换过程中荧光强度显著提升。由于在常规细胞外环境中几乎无荧光显现，这一特性可大幅减少实验中的洗涤步骤。该染料特别适用于内体与溶酶体等酸性细胞区室的监测，在吞噬体、溶酶体及内体环境中表现出显著的荧光增强效应，为这些酸性位点的精准检测提供优异解决方案，有效降低信号变异度并提升成像或流式细胞术的检测精度。

马来酰亚胺官能团使其能够特异性偶联蛋白质巯基、硫代磷酸化寡核苷酸及小分子配体，显著提升检测的特异性和重复性。此类生物偶联物不仅为吞噬作用和内吞作用等细胞过程的靶向检测分析提供关键工具，更能支持细胞功能的综合多重分析，为细胞动态学研究提供强有力的技术支撑。

产品特性：

1)     分子量：1577.83

2)     溶解度：在DMSO中溶解

3)     Ex(nm)：576

4)     Em(nm)：579

pH荧光探针（红600-PEG12 马来酰亚胺）的pH依赖性发射光谱

保存条件: 

-20℃避光保存，2年有效。

产品使用：（仅供参考）

一、储备溶液配制

所有未使用的储备溶液应分成一次性等份，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。

1. 蛋白质储备液（溶液A）

将100 µL 反应缓冲液（例如，pH ~9.0 的1 M碳酸钠溶液或1 M磷酸盐缓冲液）与 900 µL目标蛋白溶液（例如，抗体、蛋白浓度> 2 mg/mL（如果可能））混合，得到1 mL蛋白质标记储备溶液。

注意：

a)     蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，请使用1 M碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸盐缓冲液将 pH 值调节至8.0-9.0 范围。

b)     蛋白质应溶解在1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（pH 7.2-7.4）中。如果蛋白质溶解在Tris 或甘氨酸缓冲液中，则必须用 1X PBS（pH 7.2-7.4）进行透析，去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和醋酸铵）。

c)      不纯的抗体或用牛血清白蛋白 (BSA) 或明胶稳定的抗体标记效果不好。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。叠氮化钠或硫柳汞可通过透析或旋转柱去除，以获得最佳标记结果。

d)     如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，结合效率会降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

二、可选：二硫化物还原

如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用DTT或TCEP处理蛋白质以生成硫醇基团。 DTT 或TCEP将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果您使用 DTT，则必须在将pH Red 600-PEG12马来酰亚胺与蛋白质缀合之前通过透析或凝胶过滤去除游离 DTT。

三、以下是生成游离硫醇基团的示例方案：

1.      在蒸馏水中制备1 M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鲜溶液。

2.      要在 20 mM DTT中制备 IgG 溶液，请每1 mL IgG 溶液添加20 µL DTT溶液，同时充分混合。让溶液在室温下静置 30 分钟，无需额外混合，以减少半胱氨酸氧化为胱氨酸。

3.      将还原后的 IgG 通过已用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从柱中收集 0.25 mL 级分。

4.      确定蛋白质浓度并将大部分 IgG 的级分合并。这可以通过分光光度法或比色法来完成。

5.      建议在此步骤后立即进行缀合。更多详情请参阅实验方案示例。

注意：

a)     为了获得最佳结果，IgG 溶液应 >4 mg/mL。如果蛋白质低于 2 mg/mL，则应浓缩。应额外包括 10% 的缓冲液交换柱损失。

b)     还原反应几乎可以在 pH 7-7.5 的任何缓冲液中进行（例如 MES、磷酸盐或 TRIS 缓冲液）。

c)      步骤3和4可以用透析代替。

四、pH Red 600-PEG12马来酰亚胺储备溶液（溶液 B）

将无水 DMSO 添加到pH Red 600-PEG12马来酰亚胺小瓶中，制成 10 mM 储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。

注意：在开始缀合之前准备染料储备溶液（溶液 B）。及时使用。延长储存染料原液可能会降低染料活性。溶液 B 在避光、防潮的情况下可在冰箱中保存两周。避免冻融循环。

操作步骤

该方案是为将pH Red 600-PEG12马来酰亚胺与山羊抗小鼠 IgG 缀合而开发的。您的特定蛋白质可能需要进行额外的优化。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。

1. 运行缀合反应

a)     1.1使用摩尔比为 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）作为起点：将 5 µL 染料储备溶液（溶液 B，假设染料储备溶液为 10 mM）添加到小瓶中有效摇动的蛋白质溶液（95 µL 溶液 A）。假设蛋白质浓度为 10 mg/mL，蛋白质的分子量为 ~200 KD，则蛋白质浓度为 ~0.05 mM。

注意：我们建议使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）摩尔比为 10:1 的溶液。如果太低或太高，则分别确定最佳染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。

b)     1.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

2. 纯化

以下方案是使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白质缀合物的示例。

a)     根据说明准备Sephadex G-25 柱。

b)     将反应混合物（来自“进行缀合反应”）加载到 Sephadex G-25 柱的顶部。

c)      当样品刚好流到顶部树脂表面下方时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

d)     向所需样品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质缀合物（注：柱式纯化后的样品，会根据成分不同分出多个，请检查出哪些包含了我们需要的荧光素标记蛋白产物，将所有包含该目标产物的分数给取出来集中在一起。）。

注意：为了立即使用，染料-蛋白质缀合物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

注意：为了长期保存，染料-蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

 3. 表征所需的染料-蛋白质缀合物

取代度 (DOS) 是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低 DOS 的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高 DOS（例如 DOS > 6）的蛋白质也往往具有减弱的荧光。大多数抗体的最佳 DOS 建议在 2 到 10 之间，具体取决于染料和蛋白质的特性。为了有效标记，应控制取代度，使 1 摩尔抗体具有 6-8 摩尔pH Red 600-PEG12马来酰亚胺。以下步骤用于确定pH Red 600-PEG12马来酰亚胺标记蛋白质的DOS。

4. 测量吸收率

a)     要测量染料-蛋白质缀合物的吸收光谱，建议根据染料的消光系数将样品浓度保持在 1-10 µM 范围内。

b)     在 280 nm 处读取 OD（吸光度）和染料最大吸光度（对于pH Red 600-PEG12马来酰亚胺染料，ƛmax = 576 nm）

c)      对于大多数分光光度计，样品（来自柱馏分）需要用去离子水稀释，以使 OD 值在 0.1 至 0.9 范围内。外径（吸光度）280 nm 是蛋白质的最大吸收，而 576 nm是pH Red 600-PEG12马来酰亚胺的最大吸收。为了获得准确的DOS，请确保缀合物不含非缀合染料。

注意事项：

1.      荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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