大型真菌囊泡提取纯化试剂盒

产品简介：

大型真菌囊泡在免疫调节、抗肿瘤及神经修复等治疗中具有重要作用，但其提取面临子实体组织成分复杂（如多糖、萜类等干扰物）和细胞壁结构致密的技术瓶颈，导致囊泡提取得率低、纯度不足。

本试剂盒专为大型真菌设计，可高效释放真菌子实体组织中的囊泡，并去除子实体组织中的非囊泡成分，获得的大型真菌囊泡可用于电镜分析、NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。

保存条件: 

Solution A -80℃保存，有效期1年，使用前4℃化冻，分装使用避免反复冻融；

其他组分常温运输保存，有效期1年。

产品组成：

* Nuclease-free, Sterile

自备材料：

一、实验材料/耗材

1、削皮刀、水果刀、玻璃砧板等（可以把待提取大型真菌处理成方便榨汁的小块的用具）；

2、400 mL烧杯1~2个；

3、50 mL离心管、1.5mL EP管若干；

4、pH试纸，1~10（广泛），5.5~8.5（精密）。

二、实验设备

电子秤；碾磨榨汁机（推荐使用，可搜索原汁机购买）；4℃高速离心机；水浴锅；涡旋振荡器。

三、实验试剂

1×PBS溶液（无菌）

产品使用：

一、榨汁前准备

1、榨汁机消毒：将榨汁机各部件拆分开，喷洒75%酒精仔细擦拭后，放入生物安全柜紫外消毒至少20 min；

2、样品准备：按照试剂盒处理量准备待提取样品；

注：试剂盒处理量

3、样品处理：将新鲜的待提取大型真菌洗净外表皮后，用无尘布擦干，放入生物安全柜紫外消毒至少20 min后，将真菌子实体切成方便榨汁的薄片；

注：一般药用大型真菌含水量很少，榨汁阶段无法出汁，所以尽量将真菌子实体组织处理成尽可能小的薄片。

二、榨汁取渣

1、榨汁机准备：在生物安全柜下，将完成消毒的榨汁机 部件按照榨汁机说明书组装；

2、榨汁取渣：将处理好的真菌子实体小片投入榨汁机榨汁，注意少量多次，收集出渣口碾磨粉碎后的真菌渣；

注：a. 如需控制内毒素，榨汁取渣过程请在生物安全柜内进行；b. 如果收集到的真菌渣中仍有未粉碎完全的子实体组织，建议将收集到的真菌渣重新榨汁粉碎。

3、真菌渣分散：向收集好的真菌渣中加PBS，边加边搅拌混匀，直至真菌碎渣完全分散在PBS中，且混匀后的液体有良好的流动性；

注：a. 如需控制内毒素，榨汁取渣、真菌渣分散过程请在生物安全柜内进行； b. 分散所加的PBS体积需要根据真菌渣释放出内容物的粘稠程度而定，可以少量多次加，及时搅拌观察 液体状态。

三、提取囊泡

1、汁液预处理：在分散好的真菌渣液体中加入混匀的Solution A 试剂，添加剂量如下（其他剂量可按添加比例换算）：

注：Solution A 试剂使用前需混匀。

2、混合孵育：加入Solution A试剂后盖好管盖，颠倒混匀8~10次，将混合液37℃水浴16 h左右（过夜）；

3、调pH：将孵育好的混合液取出，在生物安全柜下用试剂盒自带的1M NaOH和1%柠檬酸将混合液pH调至7.0；

4、低速离心去杂：将调pH后的液体于4℃，5,000 ×g，10 min 离心，收集上清；

5、高速离心去杂：将低速去杂后的上清4℃，10,000 × g，20 min离心后再次收集上清；

6、过滤：将上步收集得到的上清依次经1 μm滤膜和0.45 μm滤膜过滤；

注：如需获得30-1000 nm大型真菌囊泡，可只进行 1 μm滤膜过滤，不进行0.45 μm滤膜过滤。

7、加提取试剂：取上步离心上清液加入Solution B试剂， 添加剂量如下（其他剂量请等比例换算）：

8、二次混合孵育：加入Solution B后拧紧管盖，通过涡旋振荡器混匀1 min，将混合液4℃静置4 h左右；

9、沉淀大型真菌囊泡：取孵育好的混合液于4℃，10,000 ×g，60 min 离心，弃上清，将含有沉淀的离心管再次于4℃，10,000 g，2 min离心后，吸尽上清；

注：沉淀中富含大型真菌囊泡，需尽可能吸尽上清液。

10、大型真菌囊泡重悬：取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀，待其溶解后，将重悬液转移至新的1.5 mL EP 管中（建议每20 mL汁液用400 μL左右1×PBS重悬）；

11、大型真菌囊泡收获：将含有重悬液的1.5 mL EP管于 4℃，12,000 ×g 离心 2 min，保留上清液，其中富含大型真菌囊泡颗粒；

注：若沉淀较多，可12,000 ×g，2 min离心多次至无明显沉淀，每次取上清。

四、纯化和保存大型真菌囊泡

1、囊泡纯化：将收获的大型真菌囊泡颗粒粗品转入Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以3,000 ×g 离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的大型真菌囊泡颗粒；

注：a. EPF柱不可重复使用； b. 如需获得大颗粒囊泡，可不进行该步骤。

2、囊泡保存：纯化后的大型真菌囊泡以合适体积进行分装冻存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。

结果展示：

粒径及BCA结果展示

注意事项：

1.      试剂盒内的Solution A溶液，可以按照单次使用量分装，保存在-80℃，使用前4℃解冻，解冻后尽快用完，禁止反复冻融。

2.      Solution A 试剂静置有棕黄色沉淀，属于正常现象，使用前需混匀。

3.      若对内毒素有严格要求，榨汁步骤请严格在生物安全柜下进行，关键用品和仪器注意消毒后使用。

4.      纯化后的大型真菌囊泡可保存在-80℃冰箱中，避免反复冻融导致囊泡破裂。

5.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！

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