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干货 | WB 实验中的关键控制点和注意事项

栏目：技术支持
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满怀期待跑 WB，拍照后却发愁了，条带怎么这么弱？这种时候，相信很多小伙伴都百思不得其解，除了发问“条带去哪了”，还一度相信 WB 就是门玄学。长此以往，大家面对 WB 实验似乎都抱有“心诚则灵”的无力态度，万一成功了呢？

玩笑归玩笑，言归正传，面对不好拿下的 WB 实验，“心诚则灵”是有道理的。“心诚”的意思是，面对失败的实验我们有必要用心逐一排查问题所在，优化实验体系。总而言之在繁琐复杂的 WB 面前，没有任何捷径。

本期的干货课堂我们就来重点探讨 WB 实验中的一些关键控制点，并提供实用的 Tips 供大家参考。

WB 实验步骤


WB 实验中的关键控制点和注意事项

Key Points about WB


一

WB 样本的制备


1

将样品置于冰上或者维持在 4℃ 下


2

选择合适的抑制剂


抑制剂推荐


蛋白酶抑制剂

在细胞破裂蛋白抽提的过程中，这些蛋白酶也会被一起释放出来，混入蛋白样品中，对蛋白样品造成降解



磷酸酶抑制剂

*（检测磷酸化条带时必须要添加）

磷酸酶机理：通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基

二

选择合适的蛋白定量方法


1

进行 Bradford 分析、Lowry 分析或二喹啉甲酸 (BCA) 分析


2

通常使用牛血清蛋白 (BSA) 作为蛋白质标准品

三

WB 电泳分离


1

用还原及变性的缓冲液 (e.g. Laemmli buffer)将蛋白变性，准备上样

使多肽带上负电荷

使蛋白变性并将多肽拉直

将二硫键打断

使抗原表位暴露出来


2

凝胶上样

20-40 µg 全细胞裂解液或 100 ng 纯化蛋白

每条泳道上相同蛋白量

根据目标蛋白的表达量优化上样量


3

分离胶选择 Tips（FuturePAGE蛋白预制胶）

分子量 4-40 kDa，分离胶浓度 20％

分子量 12-45 kDa，分离胶浓度 15％

分子量 10-70 kDa，分离胶浓度 12.5％

分子量 15-100 kDa，分离胶浓度 10％

分子量 25-200 kDa，分离胶浓度 8％

四

WB 的蛋白转膜

电泳结束后，凝胶(带有已分离的蛋白)与膜紧贴放置，使用电流把蛋白从凝胶转到膜上。转膜结束后可用丽春红进行可逆转色判断转移效果。

1

膜的类型

硝酸纤维素膜（NC 膜），韧性差，低背景

Polyvinylidene Difluoride (PVDF 膜转印包)，甲醇激活，蛋白结合力强

2

转膜 Tips

对于分子量较大的靶蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入 SDS 至终浓度为 0.1％；对于分子量较大的靶蛋白，推荐在转膜缓冲液中使用 10％ 或者更低浓度的甲醇；对于分子量较小的靶蛋白，推荐在转膜缓冲液中使用 20％ 甲醇

对于分子量较大的靶标蛋白，建议使用 0.45 μm 的 PVDF 膜；对于分子量较小的靶标蛋白，建议使用 0.22 μm 的 PVDF 膜


五

WB 的封闭处理


膜封闭处理可降低一抗/二抗的非特异性结合。



常用的封闭剂


5% 脱脂奶粉 in TBST

5% BSA in TBST

六

抗体孵育


1

一抗特异性地检测目标蛋白

一抗室温孵育 1-2 h 或 4 ℃ 过夜孵育

选用适合的一抗工作浓度或稀释度

一抗可以用封闭液来稀释

WB 信

2

二抗辨认一抗的恒定区

（具有物种特异性）


二抗室温孵育 1-2 h

选用适合的二抗工作浓度或稀释度，一般工作浓度要低于一抗

二抗可以用封闭液来稀释

二抗带有标签


七

WB 的信号检测



检测方法分为化学发光检测和荧光检测。


号检

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