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干货 | DNA 在琼脂糖凝胶中的迁移速率受哪些因素影响？

栏目：技术支持
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跑电泳是分子生物学实验的一项基本技术。而琼脂糖凝胶电泳作为生物学实验中最常用的技术之一，其主要特点有哪些？DNA 在琼脂糖凝胶中的迁移速率又受什么因素影响呢？


今天，就来为大家做详细的解读与探讨！准备好迎接满满的干货吧~

琼脂糖凝胶电泳


琼脂糖作为凝胶电泳常用支持物，其纯度会直接影响DNA的分辨能力及电泳结果的清晰度。

MonTrack™ Agarose琼脂糖是标准熔点琼脂糖，专为常规分离分析而设计，可分离50~15,000 bp范围内的DNA和RNA 片段。

MonTrack™ High Gel Strength Agarose与高纯度琼脂糖相比，分离范围相同，硬度提高33%，制胶厚度低至3~4mm时仍能够保持凝胶的完整性。


高纯度琼脂糖(ME00101) /高硬度琼脂糖(ME00201)


我们知道，琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定 DNA、RNA 的方法，这种

电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA＞IDNA＞ocDNA。
核酸分子是两性解离分子，pH 3.5 是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH 8.0-8.3 时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对迁移速率影响不大。在中性或碱性时，单链 DNA 与等长的双链 DNA 的迁移速率大致相同。

那么，DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率会受哪些因素影响呢？



DNA 在琼脂糖凝胶中的迁移速率：

影响因素有哪些？



1

通过凝胶的电流

根据欧姆定律 V = IR 式中, V 是电压; I 是电流（单位安培）; R 是电阻（单位欧姆）。因为用于电泳的缓冲液通常是微碱性的（pH 7.8~8.0），通过凝胶的 DNA 分子携带负电荷，并以所施加的电流形成的速率向阳极迁移。


2

DNA 分子的大小

双链 DNA 分子在凝胶基质迁移的速率与其碱基对数的常用对数( log10 )成反比（Helling et al. 1974）。大分子 DNA 摩擦阻力大，通过凝胶孔径的效率低于小分子 DNA ，因此迁移速率慢。


3

琼脂糖浓度

琼脂糖凝胶是由氢键和疏水作用聚合在一起的多孔胶体。在电流的作用下，DNA 线性分子通过一系列孔径泳动，这些孔径的有效直径取决于凝胶中琼脂糖的浓度（如下图所示）。

在 DNA 电泳迁移率(μ)的对数和凝胶浓度 (ι) 之间存在线性关系，这种相关性可以用方程式来表示：
logμ= logμ0-Kr 
式中, μ0 是 DNA 自由电泳迁移率， Kr 是阻滞系数，是一个与凝胶性质、迁移分子大小和形状相关的常数。


4

DNA 的构象

超螺旋环状（Ⅰ型）、切口环状（Ⅱ 型）和线性（Ⅲ 型） DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率不同（Thorne 1996，1967）。

上述三种类型 DNA 的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，但是同时，电流强度、缓冲液离子强度、以及Ⅰ型超螺旋 DNA 的绞紧程度或密度也都影响相对迁移率（ Johnson and Grossman 1977）。
在一些条件下，Ⅰ型 DNA 比 Ⅲ 型 DNA 迁移得更快；在另一些条件下，顺序可能颠倒。绝大多数情况下，区分不同构象 DNA 的最佳方式是在电泳系统中加入未处理的环状 DNA 样品和在单一限制酶切位点经酶切消化后的同一线状 DNA 样品。


5

凝胶和电泳缓冲液中的染料

染料插入双链 DNA 造成其负电荷减少，而刚性和长度增加。因此,线状 DNA-染料复合物在凝胶中的迁移率约降低15%（ Sharp et al.1975）。


MonTrack™ 安全核酸染料Safe Green Plus



6

施加电压

低电压时，线状 DNA 片段迁移率与所用的电压成正比。但是，电场强度升高时，高分子质量 DNA 片段的迁移率不成比例增加。所以，当电压增大时，琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA 片段的良好分辨率，则所用电压不应高于5~8 V/cm。


7

琼脂糖种类

常见的琼脂糖主要有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖（ Kirkpatrick 1990），正在研制的第三种是熔点和凝点介于上述二者之间的琼脂糖，它兼有两者的特性。



8

电泳缓冲液

DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子（如用水替代电冰槽及凝胶中的缓冲液）则电导率降至很低。DNA 迁移极慢，或者完全不动。高离子强度时，如错用了10×电泳缓冲液，电导率升高,即使应用适中的电压也会产生大量的热量。最严重时凝胶会熔化，DNA 会变性。



如何选择电泳缓冲液


 

有几种缓冲液适用于天然双链 DNA 的电泳,它们包括 Tris -乙酸盐和 EDTA 缓冲液（pH 8.0， TAE ,也称为 E 缓冲液）、Tris -硼酸盐和 EDTA 电泳缓冲液（ TBE ）或 Tris -磷酸盐和 EDTA 电泳缓冲液（TPE ），工作浓度约50mmol/ L ，pH 7.5~7.8。各种电泳缓冲液通常配制成浓溶液于温室存放（见每种实验方案后的配方）。这些缓冲液都非常有效，选择哪一种使用主要看个人工作习惯。

 

三者之中 TAE 的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗。此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化，凝胶中向阳极迁移的溴酚蓝的颜色呈现从蓝紫色到黄色的变化。该颜色变化从pH 4.6开始，到pH 3.0终止。定期更换缓冲液或调换两个电极池的缓冲液可以防止 TAE 的消耗。TBE 和 TPE 比 TAE 花费稍贵些，但是它们有高得多的缓冲容量。

 

双链线状 DNA 片段在 TAE 中比在 TBE 或 TPE 中迁移速率快10%左右。对于高分子质量 DNA ，TAE 的分辨率高于 TBE 或 TPE ；对于低分子质量 DNA ，TAE 要差些。此差别也许解释下述现象：高度复杂混合物中的 DNA 片段，如哺乳类动物 DNA ,用 TAE 电泳可有较高分辨率。因此，用于分析复杂基因组的 Southern 印迹( Southern blot )均用 TAE 作为电泳缓冲液制备凝胶和电泳。超螺旋 DNA 在 TAE 中的电泳分辨率要好于 TBE 。

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