重组蛋白的保存方法和使用

无论是保存还是运输，请避免反复冻融。反复冻融，冰晶会破坏重组蛋白的空间结构，导致蛋白变性形成多聚体和重组蛋白构象改变，从而加快了重组蛋白的降解速度。重组蛋白保存得当与否，直接决定了重组蛋白的活性使用效果。

一 溶解(冻干粉蛋白产品)

Step 1-离心：开盖前离心试剂管，可以选用快速离心10000-12000rpmx30s 或者3000-3500rpmx5min，效果良好。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上，所以在打开塑料瓶盖前，需将冻干粉通过离心收集到管底，以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。

Step 2-重悬：用推荐的稀释液稀释并重悬至0.1-1.0mg/ml，不可振荡。这个步骤即为溶解步骤，非常重要。需要用推荐的稀释液重悬，并确保重悬液到指定的浓度范围，不可以进行涡旋振荡。

Step 3-短期保存：该重悬液在2-8℃最长可保存1周，用于短期实验，方便实验取用。

Step 4-长期保存：如果实验周期长于一周，或配制的重组蛋白一次用不完，需对其进行长期保存。方法是：将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白，如0.1%BSA或者10%FBS或者5%HSA或者5%海藻糖的的溶液将重悬液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃。

二 稀释

可以用PBS或者细胞基础培养基配制，0.1%BSA或者10%FBS或者5% HSA或者5%海藻糖的稀释液备用（确保无菌）。可以使用以上四种稀释液的任意一种稀释重悬的蛋白溶液，稀释浓度根据您的使用浓度确定，不要低于10ug/ml。即可分装成小管，冻存在-20到-80度

三 蛋白产品的保存

几种蛋白保存条件对比

短期保存：

储存在4°C溶液中

将浓缩蛋白质储存在单一溶液（如PBS），置于聚丙烯管或干净的玻璃容器中，放在4°C冰箱保存。即提即用的蛋白溶液液非常适合如此保存。

优点：蛋白容易获得，可以快速进行实验，且同一管样品可重复取样，这样避免了因经常解冻而加速蛋白的降解。

缺点：在重复取样时，温度升高且暴露于环境中，可能会导致微生物污染，蛋白质失活和氧化。要避免这种情况，可以把蛋白质分成小份储存，并加入蛋白酶抑制剂、抗菌剂和还原剂等。但也要根据自己蛋白的情况，如果你的蛋白是完整的膜蛋白或分泌蛋白,很可能分子内存在二硫键，为保证其完整性，应该存储在氧化环境中。另外，储存时间超过一个月的蛋白可以考虑扔掉。

长期保存：

方案一：加入冷冻保护剂，储存在-20°C可以将蛋白保存在含有25-50% (w) 甘油或乙二醇溶液中。

优点：在低温下，蛋白质对微生物污染，蛋白酶降解和氧化反应更有抵抗力，容易保证其活性。用甘油或乙二醇稀释使蛋白处于溶液中，可以方便取样。此外，这种方式储存的蛋白质可以保存长达一年。

缺点：蛋白质在-20°溶液中仍有可能遭受水解、污染和氧化，也需加入抑制剂、还原剂等。而且将样品存放在50%冷冻保护剂中有时是不可取的，取决于你接下来要做的实验。

方案二：冻存在-80°C或液氮中将蛋白质分装成一次使用的量，快速冷冻。

优点：可以长期保存（多年)，不需要甘油、叠氮化钠等化学物质，避免蛋白质降解或微生物污染。

缺点：冷冻蛋白质应一次性使用，为了避免反复冻融发生降解。此外,抗体轭合物(特别是碱性磷酸酶复合物)冷冻后可能会失活。

方案三：冻干粉末将蛋白质脱水冻干成粉末，在冰箱中无限期存放。

优点：蛋白质不会像在水溶液中发生会水解和其他形式的化学降解，冻干蛋白质的空间也比溶液要小，而且可以长期储存。

缺点：冻干并不适用于所有蛋白质，与细胞膜相关的蛋白质容易被冻干破坏。而且，并非所有的蛋白质都冻干后都能保持稳定性，有的可能会变性，从而减少它们的有用性和再溶解的能力。此外，一些蛋白质可能需要与蔗糖、甘露醇或BSA等才能保持稳定。

蛋白储存的几个技巧

分装：无论是冷冻还是储存在溶液中，将蛋白进行分装，以避免冻融，降低污染的风险。
高浓度：一方面高浓度蛋白能更能减少与塑料或玻璃结合，另一方面高浓度有利于蛋白质的稳定。可以将蛋白浓缩至1mg/ml以上，或选择添加BSA等增加蛋白的浓度。
低温：蛋白产品对温度比较敏感。一方面在较低的温度下，蛋白分子的热运动较低，分子内部成键不容易断裂；另一方面溶液中可能存在的蛋白酶活性较低，微生物不容易生长。
无菌：进行蛋白实验时，一定要戴手套，为了防止细菌的生长，蛋白质最好保存在灭菌的小管中。
速冻与速融：蛋白质溶液保存中的冷冻过程，里面的纯水首先会结为冰，这样蛋白质分子就会被暴露在高盐浓度或者pH环境下，蛋白的活性可能会破坏。因此，尽可能缩短冷冻的过程和时间。速冻可以在液氮中进行，也可以在干冰，乙醇和丙酮的混合物中进行。速冻后，蛋白质可以保存在-20度或-80度中。同样的道理，蛋白质融化的过程也要尽可能的快速，可以在温水中进行。
不可振荡：震荡产生的剪切力有可能会对蛋白质产生破坏作用。震荡时溶液中会产生气泡，氧气的进入会导致蛋白质处在氧化环境中。蛋白质中含有半胱氨酸，其极易被氧化为胱氨酸，这一过程很可能会破环蛋白质的活性。这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡(vortex)。可以用枪头轻轻吹打几次助溶，也可以轻轻用手翻转瓶子或把瓶子放在一个缓慢摇摆的摇床上，这样做来保证缓冲液能够接触到瓶子的整个内壁。
保护剂：添加乙二醇或甘油等保护剂，使蛋白稳定，防止结冰。抑制微生物的生长，添加硫柳汞01%(w / v)或叠氮化钠0.05%(w / v)。阻止半胱氨酸氧化，可以加入1-5mM还原剂，例如DTT。
蛋白酶抑制剂：添加EDTA 、PMSF等蛋白酶抑制剂来减少蛋白质降解。

蛋白中常见的添加试剂

蛋白酶抑制剂：有蛋白酶抑制剂混合物，能够抵抗多种蛋白酶的剪切和破坏。以下为常见的蛋白酶抑制剂

抗冻剂（例如乙二醇，甘油等）：25%-50%浓度加入，防止结冻产生冰晶。
抗菌剂：0.02-0.05%的叠氮化钠或者0.01 %的硫柳汞，抑制微生物。
蛋白稳定液：可用于蛋白冷藏或者冷冻保存，适用于酶类或者需要维持完整功能的蛋白。
金属离子螯合剂（EDTA）或者还原剂（DTT），维持半胱氨酸还原状态，防止被氧化。