外泌体/囊泡样本收集指南

一、样本制备原则：

1. 代表性和一致性原则

取样的代表性和一致性关系到实验结果是否具有科学意义，应根据实验目的慎重选择取样方案。应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，保证实验结果的可信度。

2. 准确性原则

准确记录代表性样本的各种特征数据，按要求(低温、迅速)采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

3. 迅速性原则

样本质量是影响实验结果的最关键因素，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

4. 低温原则

所取样本离体后，应依据样本类型迅速采取低温措施:动物及人体组织、体液等样本应尽快置于干冰或-80°C保存；植物样本应尽快置于冰袋或4°C环境冷藏保存，以避免外泌体/囊泡降解。

注意：不接收任何具有传染性和致病性样本。

二、样本制备指南：

1. 细胞上清

1)   细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间，贴壁细胞密度在70%-80%，悬浮细胞密度在60%-70 %;

2)   对于贴壁细胞，去除原有培养基，加入适量的PBS缓冲液冲洗一次，彻底去除血清；对于悬浮细胞，300g，4°c，10min收集细胞，然后换为新的不含外泌体的培养基或者无血清替代培养基继续培养24-48小时，根据细胞的生长速度确定收取上清时间;

3)   收集细胞上清，300g，4°C，离心10min，小心收集上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片；

4)   3000g，4°C，再次离心15 min，确保将细胞或者细胞碎片去除干净;

5)   取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，合并相同的细胞培养液上清样品，装入无菌容器，可在4°C短期保存(1-2天)，长期保存可冻存于-80°C。建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离，保存会对产量有一定的影响。

注意事项:

1)     细胞生长正常。换去外泌体胎牛血清(或外泌体专用无血清培养基)时的细胞密度与收培养上清时的细胞密度，一定要有显著增长，例如从60~70%长到90~95%。如细胞无显著增殖生长则无需收样检测，基本没有多少外泌体分泌。也应避免细胞长得过满导致细胞凋亡，细胞凋亡可能降解外泌体。

2)     及时离心处理。收集细胞上清后第一时间离心去除细胞及细胞碎片，离心后的细胞上清再放入-80°C冰箱保存，避免外泌体因细胞及细胞碎片存在而导致外泌体降解。

3)     无血清替代培养基并非指的是DMEM、1640此类基础培养基，而是可以正常维持细胞生长的无血清替代培养基。

试剂盒推荐：NW3209 外泌体提取纯化试剂盒（细胞上清）；NW3316 外泌体提取纯化试剂盒-柱法（细胞上清）；NW3317 去外泌体胎牛血清；NW3302 外泌体专用无血清培养基。

2. 血液

外泌体血液样本提取时，血清和血浆都可以正常提取。如果提供全血，是无法完成的，必须提前做好血清或者血浆的分离。以下是全血、血浆、血清的区别:

1)     全血：通过采血管采集后，经过抗凝处理的全部血液。

2)     血浆：经过抗凝处理的全血，进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。

3)     血清：不经过抗凝处理的血液，让它自行凝固，再进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。

全血经过长时间放置，或通过冷冻、或高速离心后，会发生溶血，此时无法提取外泌体。所以，一定要提前做好血清或者血浆的分离，并且采血后尽快进行分离，期间不能经过冷冻，离心时转速不可太高，离心后取上清即可，发生溶血的样本应丢弃。因血液在凝血过程中血小板受到刺激会产生大量外泌体，因此若需要排除血小板外泌体的影响应采用血浆进行外泌体提取检测。

具体血液样本操作如下:

1) 采血时间一般为早晨或上午;

a、血浆：将抗凝管收集的全血2mL，轻柔上下颠倒混匀;

b、血清：收集不加抗凝剂的全血2mL，加入到离心管或促凝管中，凝血后进行下一步离心;

2) 在1小时(室温条件下)或2小时(4°C条件下)内进行下面的操作：4°C，1900g离心10分钟;

3) 吸取约1mL上清转至洁净的1.5mL 离心管中，16000g，4°C，离心10分钟，小心吸取上清到新的离心管中;

4) 放入-80°C冰箱中保存;

5) 填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

试剂盒推荐：NW3314 外泌体提取纯化试剂盒（血清血浆）；NW3315 外泌体提取纯化试剂盒（血清血浆）升级版。

3. 尿液

1) 采集中段晨尿，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液20-100mL，并注意避免细菌污染，收集前注意对饮食的控制，于4°C临时保存(不得超过8h);

2) 300g，4°C，离心10min，去除细胞等杂质;

3) 3000g，4°C，离心15min，去除细胞碎片等杂质;

4) -80°C冰箱中保存;

5) 填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

试剂盒推荐：NW3210 外泌体提取纯化试剂盒（尿液）。

4. 唾液

1) 唾液的成分会因取样的位置和时间不同而不同，在收集的时候需固定位置或是收集所有的唾液以及定时取，至少5mL。一般建议采样1h之内不得进食和刷牙;

2) 300g，4°C，离心10min，去除细胞等杂质;

3) 3000g，4°C，离心15min，去除细胞碎片等杂质;

4) -80°C冰箱中保存;

5) 填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

试剂盒推荐：NW3212 外泌体提取纯化试剂盒 (体液)。

5. 乳液

1) 新鲜采集乳液，前2mL左右乳液应弃去，收集至少5mL，于4°C临时保存(不得超过8h);
2) 300g，4°C，离心10min，去除细胞等杂质；

3) 3000g，4°C，离心15min，去除细胞碎片等杂质;

4) -80°C冰箱中保存;

5) 填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

试剂盒推荐：NW3213 外泌体提取纯化试剂盒（乳液）。

6. 组织块

1) 切取新鲜的组织块0.5-1g左右，若为临床样本则按实际大小收集，装入样本冻存管中，若体积较大，需用手术刀或手术剪分割后保存;

2) -80°C冰箱中保存;

3) 填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

试剂盒推荐：NW3211 外泌体提取纯化试剂盒（组织）。

7. 脑脊液

1) 收集脑脊液10mL，样本一经分离，请务必立即置于冰上或4°C短暂保存(不得超过4h),避免受到血液污染;

2) 300g，4°C，离心10min，去除细胞等杂质;

3) 3000g，4°C，离心15min，去除细胞碎片等杂质;

4) -80°C冰箱中保存;

5) 填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

试剂盒推荐：NW3212 外泌体提取纯化试剂盒 (体液)。

8. 胸水/腹水

1) 收集胸水/腹水后于4°C临时保存(不得超过8h);

2) 300g，4°C，离心10min，去除细胞等杂质;

3) 3000g，4°C，离心15min，去除细胞碎片等杂质;

4) -80°C冰箱中保存;

5) 填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

试剂盒推荐：NW3212 外泌体提取纯化试剂盒 (体液)。

9. 菌液上清

1) 收集菌液，300g，4°C，离心10min，小心收集上清，注意避免吸入菌体或菌体碎片;

2) 3000g，4°C，再次离心15min，确保将菌体及菌体碎片去除干净;

3) 取上清，注意避免吸入菌体及菌体碎片，合并相同的菌液上清样品，装入无菌容器，可在4°C短期保存(1-2天)，长期保存可冻存于-80°C。建议菌液上清分离后尽快进行外泌体分离，保存会对产量有一定的影响。

试剂盒推荐：NW3209 外泌体提取纯化试剂盒（细胞上清）。

10. 外泌体

1) 收集细胞上清或其他样本抽提外泌体后，用100μl-500μl PBS重悬沉淀;

2) 放入-80°C冰箱中保存。

3) 填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

11. 植物样本

为确保植物外泌体提取的一致性与可靠性，请客户提供新鲜、完整的植物组织样本。

1) 通用要求

a)     状态：完整、未处理的新鲜植物样本。

b)     保存：采集后立即用冰袋或置于4°C环境。

c)      运输：必须使用足量冰袋与保温箱，确保全程0-4°C，并在24小时内送达。

d)     记录：详细填写《样本登记单》，注明植物种类、部位、采集时间。

2) 各类植物样本采集指南

三、样本包装及存储：

1)     在样本保存管管壁和管盖上，用油性记号笔标明样本编号及名称等信息，避免被乙醇等有机溶剂抹掉;

2)     如使用离心管，需用封口膜封口之后再冻存，避免样本漏出;

3)     尽量避免使用标签纸或应确保粘贴牢固，避免脱落造成样本混乱;

4)     样本采集后，应迅速放入高质量冻存管中，拧紧后立即放入-80°C中保存;

5)     样本应尽快进行提取检测，储存条件以及储存时间会影响外泌体得率，保存在-80°C冰箱中的样本，如果储存时间过长，外泌体产量也会显著降低;

6)     请在填写《样本登记单》时应当详细描述样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员制定合理的实验方案。

四、样本量参照表：

注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

产品订购：

本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！