Mouse Intestinal Organoid Kit 小鼠小肠类器官试剂盒

货号：K2001-MI

规格：100ml

500ml

品牌：bioGenous

产品介绍

bioGenous^TMMouse Intestinal Organoid Kit（小鼠小肠类器官试剂盒）是一款用于建立和维持小鼠肠道成体干细胞来源小肠类器官的完全培养基。生长在该完全培养基中的小鼠小肠类器官主要由干细胞、肠祖细胞和肠绒毛细胞、潘氏细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成，在自我更新能力、组织结构、细胞类型和功能方面，小鼠小肠类器官重现了体内小肠上皮的特征，因此是肠道稳态和疾病机制研究的理想体外模型。

技术参数

产品信息:

小鼠小肠类器官完全培养基的制备：

使用无菌操作技术配制小鼠小肠类器官完全培养基。以下是准备10mL完全培养基的示例，如所需量不同，可相应调整用量。

1.       冰上解冻Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意：解冻后，建议将Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 分别分装后保存取用，避免反复冻融。

2.       将200uL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40uL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)加至9.76mLMouse Intestinal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠小肠类器官完全培养基。

注意：配制后的小鼠小肠类器官完全培养基可在2-8°C储存，建议在两周内使用。Mouse Intestinal Organoid Supplement B(50x)内含有细菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠小肠类器官原代培养

1.       依据所在单位批准的实验动物伦理及操作规范牺牲小鼠。

2.       准备若干培养皿，加入4℃预冷的DPBS备用。

3.       标准手术操作取小鼠小肠，根据实验需求取总长度约3厘米至20厘米的小肠段，置于含DPBS的培养皿中。

4.       使用移液管或者注射器往小肠一端注入DPBS以冲洗肠内容物，冲洗后置于新的含DPBS的培养皿中，重复冲洗数次至内容物完全被冲洗干净，置于新的含DPBS的培养皿中。

5.       使用手术剪将肠管剪开，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗，重复清洗一次。

6.       将清洗后的小肠组织剪碎至2mm宽，并转移至含有5mmol/L EDTA的预冷DPBS中消化，置于4℃孵育30min。

7.       消化完成后，将组织碎片转移到新的含DPBS的培养皿中清洗，重复一次以去除EDTA。

8.       用5mL移液管在含冷的DPBS的培养皿或50mL离心管中吹打、重悬组织碎片，使组织反复穿过移液管尖以产生机械剪切力从而使隐窝与基底层分离，取一部分悬液镜检，当可以看到大量的隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液进行70μm滤网过滤。

9.       收集穿过滤网的组织悬液，150g离心力4℃离心3min。

10.    弃上清，使用1mLDPBS重悬组织沉淀，取20uL悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，150g离心力4℃离心3min，弃上清后置于冰上。

11.    用适量的 Matrigel重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每10uL Matrigel悬液包含200至600个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免Matrigel过早凝固。

注意： Matrigel 稀释比例应在70%以上以保证培养过程中Matrigel的结构稳定性。

12.    将Matrigel和组织细胞的混合悬液点入24孔板底部正中央，每孔30uL左右，避免悬液接触孔板侧壁。

注意：为防止Matrigel室温凝固，此步骤应尽快完成。

13.    将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固。

14.    配制小鼠小肠类器官完全培养基。

15.    待Matrigel完全凝固后，加入已配制好的小鼠小肠类器官完全培养基，24孔板每孔500uL。

注意：请沿壁缓慢加入，避免破坏已凝固结构。

16.    将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。

17.    每 3 天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏Matrigel。

18.    密切监测类器官生长状态，理想情况下，小鼠小肠类器官应在5至7天内建成。

小鼠小肠类器官传代培养

19.    用经过Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)润洗的枪头吹打刮取类器官，并将类器官和培养基的悬液转移至经过Anti-Adherence Rinsing Kit润洗的1.5mL EP管中。

20.    用经过Anti-Adherence Rinsing Kit润洗的枪头用力重悬类器官悬浮液，使得类器官与Matrigel分离。

21.    150g离心力4℃离心3min，弃上清，使用DPBS重悬底部类器官沉淀，150g离心力4℃再次离心3min，弃上清后置于冰上。

22.    用适量的 Matrigel重悬类器官沉淀，重悬后置于冰上，重悬时间不超过30s以避免Matrigel过早凝固。

注意： Matrigel 稀释比例应在70%以上以保证培养过程中Matrigel的结构稳定性。

23.    将Matrigel和类器官的混合悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔30uL左右。

注意：为防止Matrigel室温凝固，此步骤应尽快完成。

24.    将接种完成后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固。

25.    配制小鼠小肠类器官完全培养基。

26.    待Matrigel完全凝固后，加入已配制好的小鼠小肠类器官完全培养基，24孔板每孔500uL。

27.    将24孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。