Rhod-2, AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针，超级纯（NBS7640）

（长波长的可见光钙离子探针）

Rhod-2, AM, Cell Permeant 钙离子荧光探针，超级纯

货号：NBS7640

规格：50μg

品牌：NoninBio

产品描述

Rhod-2是一种高亲和力的可见光激发波长Ca2+荧光探针。类似于Fluo-3或Fluo-4，其激发和发射光谱不会随着Ca2+浓度变化发生明显的迁移，荧光信号一旦与Ca2+结合后明显增强。不同于Fluo-3或Fluo-4，Rhod-2的波长更长（Ex/Em=549/578 nm），这一特性使其更适合具高水平自荧光信号细胞或组织的Ca2+水平检测，还可用来检测由光感受器和笼锁Ca2+螯合剂光激活导致的Ca2+释放。

Rhod-2, AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Rhod-2，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的储存液，并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。

主要特征：

1）   长波长钙离子探针，能够与GFP和绿色荧光探针兼容；

2）   特别定位在线粒体。以罗丹明结构为基础的Rhod-2 AM带正电荷，以电位驱动的方式吸收聚集在线粒体，荧光显微镜下观察加载进入细胞呈现点状染色模式。有文献认为，Rhod-2是线粒体Ca2+的选择性探针，不过这一理论并未得到广泛支持。

3）   检测平台：荧光成像，流式细胞术，酶标仪，高内涵筛选（HCS）

基本特性：

1）   CAS NO：129787-64-0

2）   化学名：9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2- oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium, monobromide

3）   同义名：Rhod-2, Acetoxymethyl Ester 

4）   分子式：C52H59N4O19Br

5）   分子量：1123.96

6）   外观：红色固体

7）   最大激发/发射波长：549/578 nm

8）   Kd（Ca2+结合）：570NM

9）   溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

10）化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20℃干燥避光保存，至少一年有效。

运输：室温运输。

注意事项

1）   荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）   Rhod-2从低浓度Ca2+到高浓度Ca2+的荧光增强程度低于Fluo-3，另外，Rhod-2的荧光信号弱于Fluo-3。

3）   乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。

4）   Rhod-2, AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20-25℃温育片刻至全部融解后使用。

5）   Rhod-2, AM第一次使用，建议储存液现配现用，分装成单次用量，严格做到≤-20℃密封干燥冻存，以防止受潮。为了保证良好的实验效果，尽量在短时间内使用。

6）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法仅用作参考，可根据具体的实验条件做出调整。

A， 试剂准备

1）  配制Pluronic F-127母液：称取100mg Pluronic F-127粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

2）  HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理缓冲液

B，操作步骤

1）   用无水DMSO溶解Rhod-2, AM配制成2-5mM的储存液，或将已配好的Rhod-2, AM储存液取出于室温回温。（如：若配制成4mM的母液，需向50µg Rhod-2, AM中加入11.1µl 无水DMSO）。准备Rhod-2, AM工作液之前，有时需要往Rhod-2, AM储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性。

【注①】：Rhod-2, AM染色工作液制备前，添加等体积20% Pluronic F-127溶液到Rhod-2, AM+DMSO储存液，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但Pluronic F-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存。

2）   用HHBS或其他生理缓冲液将 Rhod-2, AM+DMSO储存液稀释到1-10µM的工作液。

【注①】：Rhod-2,AM应用在大部分细胞的推荐加载浓度为4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。

【注②】：Rhod-2, AM工作液需现配现用，避免反复冻存。

3）  【可选】如果细胞内含有机阴离子转运体，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入细胞培养基内，以降低去酯化探针的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮储存液相当偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH。

4） 将准备好的Rhod-2, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃孵育20min-2h。

【注①】：若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低Rhod-2, AM加载效果。而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次。

【注②】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果；如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。

【注③】：降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理缓冲液（如有必要，使用含转运体抑制剂如2.5mM丙磺舒的缓冲液）清洗细胞1~2次，以去除残留探针。

6） 室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。

7） 用适当的仪器如激光共聚焦、流式细胞仪、荧光酶标仪，以及波长Ex/Em=549/578 nm来进行检测。

Rhod-2 AM的应用实例：

1）   应用目的：用Ca2+荧光探针Rhod-2 AM（NBS7640）检测顺铂（cisplatin）敏感SKOV3细胞和顺铂耐性SKOV3/DDP细胞内线粒体Ca2+水平的变化。

Fig 1. 顺铂或ATP处理诱导SKOV3细胞线粒体Ca2+内流，并非SKOV3/DDP细胞。A）两种细胞系分别用ATP诱导处理，时间序列扫描检测线粒体Ca2+变化，通过共聚焦显微镜得到数据。B）细胞用6 μg/ml顺铂处理0h，8h和16h后用共聚焦显微镜检测（bar，20 μm）。

2）   应用目的：用Ca2+荧光探针Rhod-2 AM（NBS7640）检测顺铂（cisplatin）对HeLa细胞线粒体Ca2+水平的变化。

Fig 2. 顺铂增加细胞浆和线粒体内游离Ca2+水平。A）HeLa细胞用顺铂（2.5, 5 or 10 µg/ml）处理0h，6h，12h和24h后，用荧光钙离子探针Fluo-4 AM孵育。细胞浆Ca2+浓度用共聚焦显微镜观察（bar，40 μm）。B）Fluo-4 AM定量检测细胞浆内游离Ca2+水平。C）HeLa细胞用顺铂（2.5, 5 or 10 µg/ml）处理0h，6h，12h和24h后，用荧光钙离子探针Rhod-2 AM孵育。线粒体Ca2+浓度用共聚焦显微镜观察（bar，40 μm）。D）Rhod-2 A定量检测线粒体内游离Ca2+水平。