高效型 PE-Annexin V/RedNucleus Ⅱ 细胞凋亡试剂盒

（橙红色，远红）

产品简介：

PE-Annexin V/RedNucleus II凋亡试剂盒提供了一种通过标记早期凋亡细胞（橙红色）和坏死或晚期凋亡的细胞（远红）检测细胞凋亡水平的快速简便地方法。Annexin V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35~36KD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，可与磷脂酰丝氨酸 (PS) 选择性结合。磷脂酰丝氨酸 (PS) 主要分布在细胞膜内侧，即与细胞质相邻的一侧在细胞发生 凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷脂酰丝氨酸外翻到细胞表面，暴露在细胞外环境中，此时，使用藻红蛋白PE标记的Annexin V，即Annexin V-PE，与外翻的磷脂酰丝氨酸 (PS) 结合，就可用流式细胞仪或荧光显微镜直接检测到磷脂酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。对于坏死、晚期凋亡或者损伤的细胞，由于细胞完整性已经被破坏，Annexin V-PE 则可以进入胞浆与处于磷脂层内侧的PS结合，从而使坏死细胞呈现出橙红色荧光。Annexin V-PE 可以与部分非渗透性的细胞核染料 (7-AAD/PI) 等联合使用， 区分处于不同凋亡时期的细胞。

本试剂盒中提供的RedNucleus II是一种远红光染料，属于蒽醌类化合物，不能透过活细胞和早期凋亡细胞完整的细胞膜，是非渗透性的，但是可以快速染色死亡和透化细胞中的细胞dsDNA。RedNucleus II是一种理想的碘化丙啶 (PI) 和7-AAD的替代物，与 Annexin V-PE联用，无需补偿调节，具有更好的光谱特性：不受紫外线的激发，也不与PE/PE同系物重叠发射，故可以和FITC，PE及紫色荧光染料结合用于多色分析。与Annexin V-PE联用时，RedNucleus II被排除在活细胞和早期凋亡细胞外，而晚期凋亡细胞和死细胞则同时被 Annexin V-PE和RedNucleus II结合染色呈现双阳性。

保存条件: 

2-8℃保存，3年有效。

产品组成：

产品参数：

PE-Annexin V：Ex/Em：488/578nm

RedNucleusII：Ex/Em：635/695nm

产品使用：（仅供参考）

1、实验组别设计

无自发荧光样本：

自发荧光样本：

空白对照：调节阈值和仪器电压。

阴性对照：排除实验操作对实验结果的影响，扣除荧光背景，同时还可以作为实验组划门的依据。

单阳对照：调节补偿，同时也可以辅助调节该通道的电压，防止信号超出仪器接收范围。

实验组：用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

2、收集细胞

(1) 对于悬浮细胞

1) 在进行完细胞凋亡刺激后，1000rpm 离心 5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。 注：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V 的结合。

2) 取0.5~1×10⁶个重悬的细胞，1000rpm离心 5min，弃上清，加入100µL 1×Annexin V 结合缓冲液轻轻重悬细胞。

3) 加入5µL PE-Annexin V，轻轻混匀。

4) 加入5µL RedNucleus II 染色液，轻轻混匀。

5) 室温 (20~25ºC) 避光孵育10~15min。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2~3次以改善染色效果。

(2) 对于贴壁细胞

1) 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液（不含EDTA）消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，即可停止消化。这一步需避免胰酶的过度消化。 注：对于贴壁细胞，胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤， 从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性，甚至会影响细胞膜上 磷脂酰丝氨酸与Annexin V 的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。

2) 加入上步中收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000rpm离心 5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。 注：加入上步中的细胞培养液非常重要，一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血 清可以有效抑制或中和残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V，导致染色失败。

3) 取 0.5~1×10⁶个重悬的细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入100µL 1×Annexin V 结合缓冲液轻轻重悬细胞。

4) 加入5µL PE-Annexin V，轻轻混匀。

5) 加入5µL RedNucleus II 染色液，轻轻混匀。

6) 室温 (20~25ºC) 避光孵育10~15min。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2~3次以改善染色效果。

3、结果分析

(1) 流式细胞仪检测

1) 孵育完成后，可直接加入400μL1×Annexin V结合缓冲液重悬细胞，立即上机检测，PE-Annexin V由488nm/566 nm激光激发，检测荧光发射光谱在578nm处（BL2(FL2)/YL1 通道），RedNucleus II 通道发射光谱约在695nm处（RL1(FL4) 通道）。

2) 在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为 (PE-Annexin V -/RedNucleusⅡ-)；右下象限为早期凋亡细胞，为 (PE-Annexin V +/RedNucleusⅡ-)；右上象限是坏死与晚期凋亡细胞，为 (PE-Annexin V +/RedNucleus Ⅱ+)；左上象限显示裸核细胞，为 (PE-Annexin V -/RedNucleusⅡ+)。

(2) 荧光显微镜检测

1) 1000 rpm离心5min，收集细胞，用 400µL 1×Annexin V 结合缓冲液轻轻重悬细胞。将细胞移至96孔板中沉降片刻或进行细胞涂片后，置于荧光显微镜下观察。

2) Annexin V-PE 可用PE适用滤光片。RedNucleusII 可用远红长通滤光片，如 LP695/LP715/LP780。

注意事项：

1.      使用前请将产品瞬时离心至管底，再进行后续实验。

2.      为降低细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作，但孵育时间至少延长至30min。

3.      由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1h之内进行分析。

4.      为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

5.      荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

6.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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