pH荧光探针（红 600，SE）

pH-dependent fluorescence, Red 600, SE

产品简介：

pH荧光探针（红600，SE）表现出与pH值相关的荧光变化。不同于大多数在高pH值下荧光增强的荧光染料，pH荧光探针（红600，SE）在酸性环境下荧光强度得到增强。随着pH值从中性向酸性降低，pH荧光探针（红600，SE）的荧光急剧增加。其在细胞外的荧光较弱，这可能有助于减少实验中的洗涤步骤。pH荧光探针（红600，SE）是监测细胞内酸性区室，如内质网和溶酶体的强大工具。该探针在细胞外荧光较弱，但在吞噬体、溶酶体和内质网等酸性区室内荧光显著增强。这种特性使得pH荧光探针（红600，SE）能够特异性地检测细胞内的酸性区室，降低信号变异性，提高成像和流式分析的准确性。此外，pH荧光探针（红600，SE）还可以与绿色染料（例如GFP、Fluo-8、钙黄绿素或FITC标记的抗体）联合使用，进行多重细胞功能分析。由于其光谱特性与Texas Red相似，因此可以方便地使用Texas Red的常用滤光片组进行pH荧光探针（红600，SE）的实验。
保存条件: 

-20℃避光保存

 物理及光谱特性：

pH依赖性发射光谱和细胞染色：

     ：

 母液制备：

产品使用：

一、        储备液配制

1.      蛋白储备溶液（溶液 A）

将100μL反应缓冲液（例：1M碳酸钠溶液或1M磷酸盐缓冲液，pH 9.0）与900μL目标蛋白溶液（例：如可能，抗体、蛋白质浓度>2mg/mL）混合，得到1mL蛋白质标记储备液。

注意：

1)     蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用1M碳酸氢钠溶液或1M pH9.0磷酸盐缓冲液将pH值调节至8.0-9.0的范围。

2)     蛋白质应溶于pH 7.2-7.4的1×磷酸盐缓冲盐缓冲液（PBS）中。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须用1×PBS（pH7.2-7.4）进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和乙酸铵）。

3)     不纯抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体无法被很好地标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。叠氮化钠或硫柳汞可通过透析或离心柱去除，以获得最佳标记结果。

4)     如果蛋白质浓度低于2mg/mL，则偶联效率显著降低。为获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10mg/mL。

2.      pH荧光探针（红600，SE）储备溶液 （Solution B）

将无水DMSO添加到pH荧光探针（红600，SE）中，制成10mM储备液。通过移液器吹打或涡旋充分混合。

注意：

在开始偶联之前准备pH荧光探针（红600，SE）储备溶液（溶液B），现配现用。pH荧光探针（红600，SE）原液长期储存可能会降低染料活性。溶液B可在冰箱中避光、避湿储存两周，避免反复冻融。

二、        偶联山羊抗小鼠IgG的实验方案

1.      偶联反应：

1)     溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）按10：1的摩尔比混合：将5μL染料原液（溶液B，以染料原液为10mM为例）加入到蛋白溶液（95μL溶液A）中，混匀。假设蛋白质浓度为10mg/mL，蛋白质分子量为200KD，则蛋白质浓度为0.05mM。

注意：

我们建议使用10：1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）。也可根据实验需求，使用5：1、15：1和20：1的最佳染料/蛋白质比例。

2)     在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60min。

2.      纯化偶联物（以使用 Sephadex G-25 色谱柱进行染料-蛋白质偶联物纯化为例）

1)     按照制造商的指导说明准备Sephadex G-25色谱柱。

2)     将上一步偶联反应得到的混合物装载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。

3)     当样品开始在顶部树脂表面下方流动时，加入pH 7.2-7.4的PBS溶液。

4)     向所需样品中继续添加pH 7.2-7.4的PBS溶液，以完成色谱柱的纯化过程。收集含有目标染料-蛋白质偶联物的洗脱液。

注意：

a)     如需立即使用，染料-蛋白偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装以供多次使用。

b)     如需长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

3.      鉴定目标染料-蛋白质偶联物（确定pH荧光探针（红600，SE）标记蛋白质的取代度）

1)     测量吸收值

为了测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议将样品浓度保持在1-10μM的范围内，具体取决于染料的消光系数。

2)     读取 280 nm和染料发射波峰处（pH荧光探针（红600，SE）的 ƛmax = 597 nm）的 OD（吸光度）

对于大多数分光光度计，需要用去离子水稀释样品（来自色谱柱馏分），使 OD 值在 0.1 至 0.9 的范围内。280 nm 处的 OD（吸光度）是蛋白质的最大吸收，而 597 nm 是pH荧光探针（红600，SE）的最大吸收值。为了获得准确的 DOS，请确保偶联物不含非偶联染料。

3)     计算DOS

注意事项：

1.      荧光探针均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2.      第一次使用时请分装成小包装后-20℃保存，以避免反复冻融。

3.      每种蛋白质对染料与蛋白质的比例需求各异，这同样受染料特性的影响。过高的染料标记可能会削弱蛋白质的结合亲和力，而过低的染料/蛋白质比例则可能导致蛋白质偶联物的灵敏度下降。

4.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本产品仅用于生命科学研究，不得用于医学诊断及其他用途！