Calcein 钙黄绿素（常用的活细胞荧光探针）专题

背景介绍：

Calcein, AM，中文名钙黄绿素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，是最受欢迎的荧光探针之一，用来标记和监测活细胞的细胞功能。具有细胞膜渗透性，一旦进入细胞，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素（Calcein），产生强烈的绿色荧光（Ex/Em= 490nm/515nm）。因不具细胞膜渗透性，从而能被保留在细胞内。

然而，Calcein, AM的单一荧光使其很难用于多标实验，特别是Calcein与GFP完全重叠的荧光光谱，使其不可能用在GFP转染细胞的多色标记实验。为了克服这一缺陷，我司开发出Calcein Red和Calcein Deep Red两种类似物，使其能够替代Calcein AM用在活细胞的标记和功能分析的多重标记研究。

几种探针的基本特征：

表1 几种钙黄绿素（Calcein）系列探针的光谱特征

应用图片：

文献1：Yoshinori Hiraoka et al. Rapid Assessment of the Physiological Status of the Polychlorinated Biphenyl Degrader Comamonas testosteroni TK102 by Flow Cytometry. Appl Environ Microbiol. 2002 Apr; 68(4): 2031–2035.

图1：睾丸酮丛毛单胞菌（C. testosteroni）菌株TK102经Calcein, AM，PI双染后的荧光显微检测图片。（A）活细胞，仅有绿色荧光；（B）死细胞，仅有红色荧光；（C）透化处理细胞，中心是红色荧光，外缘是绿色荧光。

Fig 2. HeLa活细胞经Calcein Red（# MX3013）染色图。

操作流程（以Calcein Red，NBS2016为例）：

A， 储存液制备

储存液配制范围可为1～5 mM，具体根据工作浓度来决定，建议提前配制成1000×储存液。若使用的工作液为5μM，那么可配制5mM的储存液，即往1mg Calcein Red AM（Mw：1015.79）内加入196 μl 细胞培养级别的DMSO即可。储存液需要根据单次用量分装，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此种情况下可稳定保存数月。

B，20% Pluronic F-127制备【可选】

称取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

C，染色步骤

大多数实验体系中Calcein Red AM的工作浓度为2-5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein Red AM的最佳工作浓度，以最低的探针浓度得到最好的荧光结果为筛选原则。

1）取一管适量分装的储存液（1000×）置于室温，至少回温20min，低速离心后，用合适的缓冲液如PBS，HBSS-HEPES稀释到1×染色工作液。

【注意】：有时可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein Red AM储存液内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管Calcein Red AM储存液内加入等体积的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Red AM溶液不可长期保存，需现配现用。

2）对于贴壁细胞，先用胰酶-EDTA消化细胞，离心收集细胞（1000 rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。

3）去上清，用PBS（或者其他缓冲液）清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。

4）用1/10细胞培养基体积的Calcein Red AM染色工作液重悬细胞，37℃孵育20min～1h。

【注意】：1）若细胞自身含有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（CAT NO. NBS2007）（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育体系内以降低去酯化的Calcein Red泄露到胞外；2）降低探针加载温度，可能会减少探针区室化现象。

5）用PBS（或者其他缓冲液）洗涤细胞两次去除多余染料。

【注意】：如有必要，使用含有机阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗；

6）用含合适滤光片（Ex/Em= 560nm/574nm）的仪器进行检测。 

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注意事项：

1.      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。